Kvantifikacija NAD+ in njegovih metabolitov v išiasnem živcu miši
Uvod
Ključna vloga nikotinamid adenin dinukleotida (NAD+) in njegovih metabolitov pri staranju in nevrodegeneraciji je splošno priznana. Za spodbujanje napredka v biokemijskih raziskavah in intervencijah, usmerjenih v staranje in nevrodegenerativne bolezni, je velikega pomena natančno kvantificirati NAD+ in njegove metabolite v NAD+ reševalni poti. V tej študiji je uporabljena robustna in natančna metoda LC-MS/MS za kvantifikacijo ravni NAD+ in njegovih metabolitov v normalnem in poškodovanem mišjem ishiatičnem živcu.Omejitve obstoječih metod za kvantifikacijo NAD+ in njegovih metabolitov
Tradicionalne metode za kvantifikacijo NAD+ in njegovih metabolitov, kot so HPLC-UV, NMR, kapilarna conska elektroforeza ali kolorimetrični encimski testi, se soočajo z različnimi izzivi pri občutljivosti, selektivnosti in posrednem merjenju. Kar zadeva obstoječe teste LC-MS/MS za merjenje celičnega ali tkivnega NAD+ in njegovih metabolitov, je še vedno veliko težav, ki jih je treba premagati, kot so podaljšani časi analize, slabo kromatografsko zadrževanje in nezadovoljive oblike vrhov. Poleg tega te metode pokrivajo le eno do tri snovi v NAD+ reševalni poti.Spremembe metode LC-MS/MS
Na podlagi obstoječih testov LC-MS/MS so izvedene spremembe glede kromatografskih pogojev, nadomestne matrike in pogojev MS/MS. Natančneje, 5 μM metilen fosfonske kisline se uporablja kot dodatek mobilni fazi, kar izrecno izboljša intenzivnost signala in obliko vrhov. Glede na relativno čisto in preprosto naravo vzorcev živcev ter njihovo majhnost se kot nadomestna matrika testira ultraprečiščena voda. Namesto kolone za hidrofilno interakcijsko tekočinsko kromatografijo in hiperkarb kolone se uporablja kolona Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, katere edinstvena MaxPeak HPS tehnologija visokozmogljive površine (pasivizacija notranje stene kolone, odstranjevanje kovinske površine) omogoča visoko ponovljivost, simetrijo vrhov in bazno ločitev vseh analitov.Poleg tega so pogoji MS optimizirani za zmanjšanje interferenčnega signala NAD+ v kanalu cikličnega adenozin difosfat riboze (cADPR) ob ohranjanju odziva cADPR in nikotinamid mononukleotida (NMN), z 4000 V za napetost ionskega razprševanja, 450 °C za temperaturo turbo grelnika, 50 psi za plin 1, 50 psi za plin 2, 30 psi za zaščitni plin in 12 psi za kolizijski plin.
Reprezentativni kromatogram vzorcev živcev (normalni proti poškodovanim)
Vseh pet analitov doseže bazno ločitev, pri čemer je cADPR občutljiv biomarker v modelu nevrodegeneracije. V tej študiji aksotomija ishiatičnega živca povzroči aksonsko degeneracijo, kar vodi do znižane ravni NAD+ in povišane ravni NMN v poškodovanih živcih, kar povzroči približno 2-kratno povečanje razmerja NMN/NAD+. Hkrati se ravni nikotinamida (NAM) in adenozin difosfat riboze (ADPR) zmanjšajo za približno 2-krat, medtem ko se raven cADPR poveča za več kot 8-krat. Ti rezultati so skladni z rezultati predhodno objavljenih raziskav, kar potrjuje natančnost te modificirane metode LC-MS/MS pri kvantifikaciji NAD+ in njegovih metabolitov.
Zaključek
Ta modificirana metoda LC-MS/MS omogoča učinkovito bazno ločitev NAD+, NMN, NAM, ADPR in cADPR v kratkem času analize 5 minut, kar prispeva k zgodnji diagnozi različnih nevroloških motenj in razvoju zdravil za staranje in nevrodegenerativne bolezni.Literatura
Ma Y, Deng L, Du Z. Razvoj in validacija metode LC-MS/MS za kvantifikacijo NAD+ in sorodnih metabolitov v mišjih ishiatičnih živcih ter njena uporaba na živalskem modelu poškodbe živca. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACje od leta 2012 posvečen raziskavam in razvoju, proizvodnji in prodaji surovin za koencime in naravne izdelke, z lastnimi tovarnami, več kot 170 globalnimi patenti ter močno raziskovalno-razvojno ekipo. BONTAC ima bogate izkušnje na področju raziskav in razvoja ter napredno tehnologijo v biosinteziNAD in njegovih prekurzorjev(npr. NMN in NR). Na voljo so različne vrste NAD, vključno z NAD ER Grade (odstranjevanje endotoksinov), NAD Grade I (IVD/prehranska dopolnila/kozmetični surovi prah), NAD Grade II (API/vmesni produkti) in NAD Grade IV (če obstaja višja zahteva glede topnosti), ki so lahko na voljo v obliki liofiliziranega prahu ali kristalnega prahu. Čistost BONTAC NAD lahko doseže več kot 98 %.
