Kvantifikacija NAD+ in njegovih metabolitov v mišjih išiasnih živcih
Uvod
Ključni deli nikotinamid adenin dinukleotida (NAD+) in njegovi presnovki pri staranju in nevrodegeneraciji so bili široko priznani. Za spodbujanje napredka pri biokemijskih raziskavah in intervencijah, usmerjenih v staranje in nevrodegenerativne bolezni, je izjemno pomembno natančno kvantificirati NAD+ in njegove metabolite v poti reševanja NAD+. Tukaj se uporablja robustna in natančna metoda LC-MS/MS za kvantificiranje ravni NAD+ in njegovih metabolitov v normalnem in poškodovanem mišjem išiatičnem živcu.Omejitve obstoječih metod za kvantificiranje NAD+ in njegovih metabolitov
Tradicionalne metode kvantificiranja NAD+ in njegovih metabolitov, kot so HPLC-UV, NMR, kapilarna cona elektroforeza ali kolorimetrični encimski testi, se soočajo z različnimi izzivi občutljivosti, selektivnosti in posrednega merjenja. Kar zadeva obstoječe LC-MS/MS teste za celične ali tkivne meritve NAD+ in njegovih metabolitov, je še vedno treba premagati številne težave, kot so podaljšani časi delovanja, slabo kromatografsko retencijsko vedenje in nezadovoljive oblike vrhov. Poleg tega je mogoče s temi metodami zajeti le eno do tri snovi v poti reševanja NAD+.Spremembe metode LC-MS/MS
Na podlagi obstoječih LC-MS/MS testov se izvajajo spremembe glede kromatografskih pogojev, nadomestne matrice in MS/MS pogojev. Natančneje, 5 μM metilenfosfonske kisline se uporablja kot aditiv za mobilno fazo, ki izrecno spodbuja intenziteto signala in obliko vrha. Glede na razmeroma čisto in preprosto naravo nikoli vzorcev ter njihovo majhnost se ultračista voda testira kot nadomestna matrica. Namesto hidrofilne interakcije tekoče kromatografske kolone in hiperkarbonatne kolone se uporablja kolona Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, katere edinstvena visokozmogljiva površinska tehnologija MaxPeak HPS (pasivacija notranje stene kolone, odstranjevanje kovinske površine) omogoča visoko ponovljivost, simetrijo vrhov in ločevanje baze vseh analitov. Poleg tega so MS pogoji optimizirani za zmanjšanje motenjskega signala NAD+ v kanalu ciklične adenozin difosfat riboze (cADPR), hkrati pa ohranjajo odziv cADPR in nikotinamid mononukleotida (NMN), pri čemer je napetost ionskega pršenja 4000 V, temperatura turbo grelnika 450 °C, plin 1 50 psi, plin 2 50 psi, plin plin 30 psi in plin pri trku 12 psi.
Reprezentativni kromatogram živčnih vzorcev (normalni proti poškodovanemu)
Vseh pet analitov doseže izhodiščno ločevanje, pri čemer je cADPR občutljiv biomarker v modelu nevrodegeneracije. V tem primeru aksotomija išiasnega živca povzroči aksonalno degeneracijo, kar vodi v znižano raven NAD+ in povišano raven NMN v poškodovanih živcih, kar povzroči približno dvakratno povečanje razmerja NMN/NAD+. Hkrati se ravni nikotinamida (NAM) in adenozin difosfat riboze (ADPR) zmanjšajo približno dvakrat, medtem ko se raven cADPR poveča več kot osemkrat. Ti rezultati so skladni s prej poročanimi raziskavami, ki potrjujejo natančnost te spremenjene metode LS-MS/MS pri kvantificiranju NAD+ in njegovih metabolitov.
Zaključek
Ta spremenjena metoda LC-MS/MS omogoča učinkovito osnovno ločevanje NAD+, NMN, NAM, ADPR in cADPR v kratkem času 5 minut, kar prispeva k zgodnji diagnozi različnih nevroloških motenj in razvoju zdravil za staranje in nevrodegenerativne bolezni.Viri
Ma Y, Deng L, Du Z. Razvoj in validacija metode LC-MS/MS za kvantificiranje presnovkov NAD+ in sorodnih metabolitov pri mišjih išiadičnih živcih ter njena uporaba na živalskem modelu za poškodbe živcev. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACod leta 2012 je posvečen raziskavam in razvoju, proizvodnji ter prodaji surovin za koencime in naravne izdelke, s samostojnimi tovarnami, več kot 170 svetovnimi patenti ter močno raziskovalno in razvojno ekipo. BONTAC ima bogate izkušnje z raziskavami in razvojem ter napredno tehnologijo na področju biosintezeNAD in njegovi predhodniki(npr. NMN in NR). Na voljo je več vrst NAD, ki vključujejo NAD ER stopnjo (odstranjevanje endoksina), NAD stopnjo I (IVD/prehranski dodatek/kozmetični surov prah), NAD stopnjo II (API/vmesne sestavine) in NAD stopnjo IV (če je topnost zahtevna), ki se lahko zagotovijo v obliki liofiliziranega praška ali kristalnega prahu. Čistost BONTAC NAD lahko preseže 98 %.
