Rastno sklopljeno inženirstvo encimov z manipulacijo regeneracije redoks kofaktorjev

Vse širši nabor kemikalij se zdaj proizvaja iz obnovljivih surovin z biotehnološkimi sredstvi. Bioprocesi so močno odvisni od encimske katalize za učinkovito proizvodnjo teh spojin. Zagotavljanje optimalnega delovanja encimov v zahtevanem okolju je zato zelo pomembno za trajnostno proizvodnjo.

Lastnosti, kot so specifičnost za substrat, hitrost katalize in (termo)stabilnost, so med več kritičnimi dejavniki, ki jih je treba optimizirati za učinkovite encimske bioprocese. Ta optimizacija je lahko zamudna, draga in zahtevna, zato so učinkoviti in stroškovno ugodni načini, verjetno za rastno sklopljeno selekcijo, inženirstva encimov z zaželenimi lastnostmi zelo iskani.

Prednosti uporabe rastno sklopljene selekcije kot oblike selekcije encimov, ki vključuje povezovanje aktivnosti encima z rastjo celice. Ta metoda se lahko uporablja kot strategija selekcije z visoko prepustnostjo in se lahko doseže bodisi z zagotavljanjem, da je rast odvisna od sinteze produkta s strani ciljnega encima, bodisi s povezovanjem aktivnosti encima z globalnim energetskim stanjem celice. Sintezna biologija se lahko uporabi za inženirstvo sevov, primernih za rastno sklopljeno selekcijo, nedavni napredki pa so se osredotočili na inženirstvo sevov, pomanjkljivih v oksidiranih ali reduciranih stanjih redoks kofaktorskih parov, ki lahko služijo kot platforme za inženirstvo encimov. Uporaba teh platform lahko pospeši razvoj izboljšanih biokatalizatorjev in bioprocesov.

Prednosti rastnega sklopljenja prek kofaktorske avksotrofije

Prednosti uporabe kofaktorske avksotrofije kot metode selekcije za inženirstvo encimov, vključenih v biosintezo določenih kemikalij, kot so lipidi, biogoriva, plini, organska topila ali polimerne spojine. Ta pristop ponuja več edinstvenih prednosti, vključno z zmožnostjo selekcije za želeni produkt neodvisno od substrata ali produkta, ki nas zanima, kar olajša odkrivanje izboljšane encimske aktivnosti, in ponuja odčitek za odkrivanje izboljšane encimske aktivnosti. Poleg tega je uporaba kofaktorskih avksotrofov kot platform za rastno sklopljenje koristna, ker je vseprisotnost redoks kofaktorjev v mikrobni presnovi pomeni, da so lahko inženirske strategije prenosljive na druge mikrobe, ki nas zanimajo, in encimi se lahko neposredno inženirirajo v okolju želenega mikrobnega gostitelja. (prikazano kot slika 1)

Slika 1: Primerjava več pogosto uporabljenih tehnik presejanja/selekcije za inženirstvo encimov

Mutanti, pomanjkljivi v oksidaciji NADH

Oksidacija NADH v E. coli lahko poteka po dveh poteh, odvisno od razpoložljivosti kisika. V aerobnih pogojih se NADH večinoma oksidira z dihanjem za proizvodnjo ATP, medtem ko se v anaerobnih pogojih lahko oksidira po fermentacijskih poteh za proizvodnjo laktata in etanola. Mutantni sevi E. coli, ki ne morejo uporabljati mešanih fermentacijskih poti za oksidacijo NADH med anaerobno rastjo, so bili uporabljeni za poganjanje poti oksidacije NADH za anaerobno sintezo različnih kemikalij, kot so 2-metilpropan-1-ol, 2,3-butandiol, 1-butanol in L-alanin. Ti mutantni sevi so bili uporabljeni tudi za inženirstvo encimov z izkoriščanjem podobnih redoks principov, kar je privedlo do izboljšanih variant. Nastali sevi se lahko uporabijo za inženirstvo drugih od NAD(P)H odvisnih encimov in poti.

Mutanti, pomanjkljivi v redukciji NAD+

Wenk et al. so ustvarili sev E. coli z izbrisom gena za dihidrolipoil dehidrogenazo (lpd), kar je povzročilo, da sev ni mogel proizvajati redukcijske moči (NADH in NADPH) iz presnove acetata zaradi odsotnosti aktivnosti piruvat dehidrogenaze. To je povzročilo, da je sev izkazoval avksotrofijo za redukcijsko moč, ko je rasel aerobno na acetatu kot edinem viru ogljika. (prikazano kot slika 2) Sev je lahko rasel na acetatu, ko je bil dopolnjen z zgornjimi glikolitičnimi substrati ali ko je izražal od NAD+ odvisne format-, etanol- ali metanol dehidrogenaze z njihovimi ustreznimi substrati. Sev ni bil uporabljen za inženirstvo encimov in je bil ocenjen le za redoks kofaktorsko avksotrofijo.
 

Slika 2: Centralna presnova

Mutanti, pomanjkljivi v oksidaciji NADPH

Obstajata dve različni strategiji za indukcijo avksotrofije za NADP+ v E. coli, ki se zanašata na inženirstvo glikolitične poti za prekomerno proizvodnjo NADPH. Prva strategija vključuje izbris nativega gena gapA in izražanje heterologne od NADP+ odvisne GAPDH encima, medtem ko druga strategija vključuje preusmerjanje ogljikovega toka skozi pentoza fosfatno pot. Nastali sevi ne morejo rasti na glukozi, vendar izkazujejo rast v različnih pogojih, pri čemer prvi sev raste v anaerobnih pogojih, drugi pa v aerobnih pogojih z glicerolom kot substratom. Ti sevi se uporabljajo za inženirstvo encimov z izboljšanimi lastnostmi, vključno s specifičnostjo za substrat, katalitsko aktivnostjo in termostabilnostjo.

Mutanti, pomanjkljivi v redukciji NADP+

Tri različne bakterije, E. coli, P. putida in C. glutamicum, so bile inženirirane tako, da so avksotrofne za NADPH, kar pomeni, da za rast potrebujejo eksogeni NADPH. V primeru E. coli in C. glutamicum so bili izločeni centralni presnovni encimi, da bi se izognili redukciji NADP+ pri zagotavljanju glukoze kot vira ogljika, medtem ko je bilo pri P. putida uporabljeno inženirstvo s CRISPR/nCas9 za zaporedno motenje naborov ciljnih genov, da bi razumeli njihovo vpletenost v redoks presnovo. Sevi, avksotrofni za NADPH, so bili nato uporabljeni za rastno sklopljeno inženirstvo encimov na podlagi kofaktorske specifičnosti. En krog mutageneze z uporabo E. coli je prinesel najučinkovitejšo in najbolj specifično od NADP+ odvisno format dehidrogenazo do danes, medtem ko P. putida in C. glutamicum predstavljata prva seva svojih vrst, ki se lahko uporabita za to vrsto inženirstva.

Mutanti, pomanjkljivi v redukciji NMN+

Razvit je bil sistem selekcije, povezane z rastjo, za povezavo cikla kofaktorjev in rasti na podlagi pomanjkanja v redukciji NMN+. Uporabljen je bil sev E. coli SHuffle, ki nosi delecije v dveh genih, vključenih v proizvodnjo reduciranega glutationa. Z racionalno mutagenezo je bila razvita NMNH-odvisna glutation reduktaza, da bi proces povezali s ciklom NMN+/NMNH, in NMN+-odvisna glukoza dehidrogenaza, ki podpira cikel kofaktorjev NMN+/NMNH in s tem rast. Študija je prav tako prvič uporabila nekanonično avksotrofijo redoks kofaktorjev za inženiring encimov, povezanih z rastjo, kar je privedlo do termostabilne različice fosfit dehidrogenaze z izboljšano katalitično učinkovitostjo in časovno stabilnostjo in vitro. Delo zagotavlja uporaben sev za inženiring encimov, povezanih z rastjo, ki je odvisen od cikla NMN+/NMNH in avksotrofen za reducirano stanje nekanoničnega redoks kofaktorja.

Potencial povezovanja rasti prek redoks kofaktorjev se je izkazal kot močno orodje za inženiring biokatalizatorjev, zlasti v okviru trajnostne bioproizvodnje. Čeprav je bil dosežen precejšen napredek pri ustvarjanju sevov z avksotrofijo redoks kofaktorjev, izjava nakazuje, da obstaja še več neraziskanih raziskovalnih poti. Ena od teh vključuje inženiring sevov z avksotrofijo kofaktorjev pri organizmih, ki niso E. coli, kar bi lahko odprlo nove možnosti za inženiring encimov, povezanih z rastjo.

Na splošno nakazuje, da uporaba povezovanja rasti na podlagi redoks kofaktorjev predstavlja veliko priložnost za inženiring biokatalize, zlasti za proizvodnjo produktov, ki ne morejo izpolniti zahtev drugih visokozmogljivih pristopov za inženiring encimov. Poudarja potrebo po razvoju bolj vsestranskih in učinkovitih biokatalizatorjev za trajnostno bioproizvodnjo ter izpostavlja pomen nadaljnjih raziskav na tem področju.


Literatura: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Inženiring encimov, povezanih z rastjo, z manipulacijo regeneracije redoks kofaktorjev, Biotechnology Advances, 2023.