Inženiring encemov z rastno povezanimi encimi z manipulacijo redoks kofaktorske regeneracije

Iz obnovljivih surovin se zdaj z biotehnološkimi sredstvi proizvaja vse širši nabor kemikalij. Bioprocesi močno temeljijo na encimski katalizi za učinkovito proizvodnjo teh spojin. Zato je zagotavljanje optimalnega delovanja encimov v zahtevanem okolju zelo pomembno za trajnostno proizvodnjo.

Lastnosti, kot so specifičnost substrata, katalitična hitrost in (termo)stabilnost, so med več ključnimi dejavniki, ki jih je treba optimizirati za učinkovite bioprocese, ki jih poganjajo encimi. Ta optimizacija je lahko časovno zahtevna, draga in zahtevna, zato so učinkoviti in stroškovno učinkoviti načini za selekcijo, povezano z rastjo; inženirski encimi z zaželenimi lastnostmi so zelo iskani.

Prednosti uporabe selekcije, vezane na rast, kot oblike selekcije encimov, ki vključuje povezavo aktivnosti encima z rastjo celice. Ta metoda se lahko uporablja kot strategija izbire z visoko prepustnostjo in jo je mogoče doseči bodisi tako, da zagotovimo, da je rast odvisna od sinteze produkta s strani ciljnega encima, bodisi z povezavo aktivnosti encima s globalnim energijskim stanjem celice. Sintetična biologija se lahko uporablja za inženiring sevov, primernih za selekcijo z rastno povezanostjo, nedavni napredki pa so se osredotočili na inženiring sevov, ki jim primanjkuje oksidiranih ali reduciranih stanj redoks kofaktorskih parov, kar lahko služi kot platforme za inženiring encimov. Uporaba teh platform lahko pospeši razvoj izboljšanih biokatalizatorjev in bioprocesov.

Koristi rastnega povezovanja preko kofaktorske auxotrofije

Prednosti uporabe kofaktorske auxotrofije kot metode selekcije za inženiring encimov, ki sodelujejo pri biosintezi določenih kemikalij, kot so lipidi, biogoriva, plini, organska topila ali polimerne spojine. Ta pristop ponuja več edinstvenih prednosti, vključno z možnostjo izbire želenega izdelka neodvisno od substrata ali izdelka, kar olajša zaznavanje izboljšane encimske aktivnosti in omogoča prikaz za zaznavanje izboljšane encimske aktivnosti. Poleg tega je uporaba kofaktorskih auxotrofov kot platform za povezovanje rasti koristna, saj vseprisotna narava redoks kofaktorjev v mikrobnem metabolizmu omogoča, da so inženirske strategije lahko lateralno prenosljive na druge mikrobe, ki jih zanimamo, encimi pa se lahko neposredno inženirsko oblikujejo znotraj okolja želenega mikrobnega gostitelja. (prikazano na sliki 1)

Slika 1: Primerjava več široko uporabljenih tehnik presejanja/selekcije za encimsko inženirstvo

Mutanti, ki jim primanjkuje oksidacije NADH

Oksidacija NADH v E. coli se lahko zgodi na dva načina, odvisno od razpoložljivosti kisika. V aerobnih pogojih se NADH večinoma oksidira z dihanjem za tvorbo ATP, medtem ko se v anaerobnih pogojih lahko oksidira preko fermentacijskih poti za proizvodnjo laktata in etanola. Mutirani sevi E. coli, ki med anaerobno rastjo ne morejo uporabljati mešanih fermentacijskih poti za oksidacijo NADH, so bili uporabljeni za pogon oksidacijskih poti NADH za anaerobno sintezo različnih kemikalij, kot so 2-metilpropan-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol in L-alanin. Ti mutirani sevi so bili uporabljeni tudi za inženiring encimov z izkoriščanjem podobnih redoks principov, kar je privedlo do izboljšanih različic. Nastali sevi se lahko uporabijo za inženiring drugih encimov in poti, odvisnih od NAD(P)H.

Mutanti, ki jim primanjkuje redukcije NAD+  

Wenk in sodelavci so ustvarili sev E. coli z izbrisom gena za dihidrolipoil dehidrogenazo (LPD), kar je povzročilo, da sev zaradi odsotnosti aktivnosti piruvat dehidrogenaze ni mogel proizvajati zmanjševalne moči (NADH in NADPH) iz presnove acetata. To je povzročilo, da je sev pokazal avsotrofijo za zmanjšanje moči, ko je gojil aerobno na acetatu kot edinem viru ogljika. (prikazano na sliki 2) Sev je lahko rasel na acetatu, če je bil dopolnjen z zgornjimi glikolitičnimi substrati ali ko je izražal NAD+-odvisne formate-, etanol- ali metanol dehidrogenaze z njihovimi ustreznimi substrati. Sev ni bil uporabljen za encimsko inženirstvo in je bil ocenjen le za redoks kofaktorsko auxotrofijo.
 

Slika 2: Centralni metabolizem 

Mutanti, ki jim primanjkuje oksidacije NADPH

Obstajata dve različni strategiji za induciranje NADP+ auxotrofije pri E. coli, ki temeljita na inženiringu glikolitične poti za prekomerno proizvodnjo NADPH. Prva strategija vključuje izbris naravnega gena za gapA in izražanje heterolognega encima GAPDH, ki je odvisen od NADP+, medtem ko druga strategija vključuje preusmeritev ogljikovega toka skozi pentozno fosfatno pot. Nastali sevi ne morejo rasti na glukozi, vendar kažejo rast v različnih pogojih, pri čemer prvi sev raste v anaerobnih pogojih, drugi pa v aerobnih pogojih z glicerolom kot substratom. Ti sevi se uporabljajo za inženiring encimov z izboljšanimi lastnostmi, vključno s specifičnostjo substrata, katalitično aktivnostjo in termostabilnostjo.

Mutanti, ki jim primanjkuje redukcije NADP+

Tri različne bakterije, E. coli, P. putida in C. glutamicum, so bile inženirsko zasnovane tako, da so NADPH-auxotrofne, kar pomeni, da za rast potrebujejo eksogeni NADPH. V primeru E. coli in C. glutamicum so centralni presnovni encimi izločeni, da bi se preprečilo zmanjšanje NADP+, ko je bila glukoza zagotovljena kot vir ogljika, medtem ko je pri P. putida inženirstvo s pomočjo CRISPR/nCas9 bilo uporabljeno za zaporedno motenje nizov ciljnih genov, da bi razumeli njihovo vlogo v redoks presnovni presni. Sevi NADPH-auxotrofični so bili nato uporabljeni za inženirstvo encimov s spreženo rastjo, ki temelji na specifičnosti kofaktorjev. Ena sama runda mutageneze z uporabo E. coli je dala najučinkovitejšo in najbolj specifično NADP+-odvisno formatno dehidrogenazo doslej, medtem ko P. putida in C. glutamicum predstavljata prvi sevi svoje vrste, ki ju je mogoče uporabiti za tovrstno inženirstvo.

Mutanti, ki jim primanjkuje zmanjšanja NMN+

Razvit je bil sistem selekcije, vezan na rast, ki povezuje ciklično delovanje kofaktorjev in rast na podlagi pomanjkanja zmanjšanja NMN+. Uporabljen je bil sev E. coli SHuffle, ki vsebuje delecije v dveh genih, vključenih v proizvodnjo reduciranega glutationa. NMNH-odvisna glutation-reduktaza je bila razvita z racionalno mutagenezo, ki povezuje proces s cikliranjem NMN+/NMNH, in NMN+-odvisna glukoza dehidrogenaza je bila uporabljena za podporo cikliranju NMN+/NMNH kofaktorjev in s tem rasti. Študija je prvič uporabila tudi nekanonično redoks kofaktorsko auxotrofijo za inženiring encimov s sprepleteno rastjo, kar je privedlo do termostabilne variante fosfitne dehidrogenaze z izboljšano katalitično učinkovitostjo in časovno stabilnostjo in vitro. Delo ponuja uporabno sev za inženiring encimov, povezanih z rastjo, ki je odvisen od cikliranja NMN+/NMNH in auxotrofni za zmanjšano stanje nekanonskega redoks kofaktorja.

Potencial povezovanja rasti preko redoks kofaktorjev je deloval kot močno orodje za inženiring biokatalizatorjev, zlasti v kontekstu trajnostne bioproizvodnje. Čeprav je bil dosežen znaten napredek pri generiranju auxotrofičnih sevov redoks kofaktorjev, izjava nakazuje, da še vedno obstaja več neizkoriščenih raziskovalnih poti. Ena od teh vključuje inženiring auxotrofnih sevov kofaktorjev organizmov, ki niso E. coli, kar bi lahko odprlo nove možnosti za inženiring encemov, povezanih z rastjo.

Na splošno nakazuje, da uporaba redoks kofaktorskega povezovanja rasti predstavlja pomembno priložnost za inženiring biokatalize, zlasti za proizvodnjo izdelkov, ki ne morejo zadovoljiti zahtev drugih visokozmogljivih pristopov k inženiringu encimov. Poudarja potrebo po razvoju bolj vsestranskih in učinkovitih biokatalizatorjev za trajnostno bioproizvodnjo ter poudarja pomen nadaljnjih raziskav na tem področju.


Vir: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Inženiring enzimov s pomočjo manipulacije redoks kofaktorske regeneracije, Biotechnology Advances, 2023.