Optimizacija reakcijskih pogojev za dosego visokega izkoristka stevia rebaudiozida d
Diete z visoko vsebnostjo sladkorja so povzročile naraščajočo pojavnost različnih kroničnih bolezni, vključno z debelostjo, sladkorno boleznijo, srčno-žilnimi boleznimi in hipertenzijo, kar predstavlja pomembno globalno javnozdravstveno tveganje. Stevia Rebaudioside D (Reb D), naravno sladilo, pridobljeno iz rastlin, je pridobilo veliko pozornosti kot nadomestek sladkorja zaradi svoje ničelne vsebnosti kalorij, intenzivne sladkosti in prijetnega okusa.
Vendar pa je njena omejena prisotnost pri stevia rebaudiana Bertoni ter izzivi, povezani z nizko topnostjo in encimsko aktivnostjo rastlinske glikoziltransferaze, ovirali njeno široko komercialno uporabo. Kot odgovor na te težave so odkrili novo glikoziltransferazo, imenovano YojK, ki izvira iz Bacillus subtilis 168. Ta študija uvaja gensko spremenjeno bakterijsko glikoziltransferazo, YojK-I241T/G327N, ki je značilna po visoki topnosti in katalitični učinkovitosti, kar ponuja velik potencial za industrijsko proizvodnjo Reb D.
Razvoj zelo učinkovite metode za proizvodnjo rebaudiozida D z uporabo kaskadne reakcije encimov YojK-I241T/G327N in AtSuSy.
Da bi rešili vprašanje nizke topnosti rastlinskih glikoziltransferaz, so raziskovalci raziskovalci preučevali možnost uporabe YojK, O-glikoziltransferaze iz Bacillus subtilis 168. YojK je bil izbran zaradi dokazane glikozilacijske aktivnosti z različnimi substrati, vključno z velikimi molekulami. Po uspešni rekombinantni ekspresiji in čiščenju je bil YojK uporabljen za glikozilacijo Reb A, kar je povzročilo proizvodnjo Stevia Reb D. Encimska kinetična analiza je pokazala, da ima YojK nižjo katalitično aktivnost proti Reb D v primerjavi z drugimi glikoziltransferazami. Posledično študija nakazuje potrebo po strukturno vodenem inženirstvu za izboljšanje katalitične aktivnosti YojK za potencialne praktične uporabe. (kot je prikazano na sliki 1)
Slika 1
Optimizacija reakcijskih pogojev za dosego visokega izkoristka rebaudiozida D.
Reakcijske pogoje, vključno s pH, temperaturo in koncentracijo substrata, je mogoče optimizirati za doseganje visokega izkoristka Srevia Reb D. Študija je uporabila simulacije molekularne dinamike za raziskovanje, kako varianta YojK-I241T/G327N izboljšuje glikozilacijo Reb D. Različica je med simulacijama ohranjala stabilno vodikovo vez med Reb A in H14, za razliko od divjega tipa (kot je prikazano na sliki 2). Ta stabilnost se je raztezala tudi na razdaljo med atomom O2 Reb A in C1P pri UDPG. Izboljšana katalitska učinkovitost različice YojK-I241T/G327N je bila pripisana tem stabilnim interakcijam, kar nakazuje njen praktični potencial.
Slika 2
Slika 3
Zaključek
Ta pristop je dal 83,47 % Reb D. Pomembno je, da je dodatek 1 mM UDPG omogočil sintezo 20,59 g/L Reb D z izjemnim 91,29 % donosom, kar je preseglo prejšnje študije. Ta postopek kaže na potencial industrijske proizvodnje Reb D, zlasti po konstrukcijskem inženiringu YojK.YojK se lahko učinkovito izraža v E. coli BL21 (DE3) z visoko topnostjo. S strukturno vodenim inženiringom je bil ustvarjen dvojni mutant, YojK-I241T/G327N, ki omogoča obsežno proizvodnjo Reb D z izjemnim izkoristkom 91,29 % z recikliranjem UDPG, ki ga katalizira saharozna sintaza AtSuSy. Ta študija predstavlja YojK-I241T/G327N kot obetavno orodje za ekonomsko učinkovito industrijsko proizvodnjo Reb D.
