Optimizacija reakcijskih pogojev za doseganje visokega izkoristka stevia rebaudiozida D
Diets with high sugar content have led to an increasing prevalence of various chronic diseases, including obesity, diabetes, cardiovascular diseases, and hypertension, which represents a significant global public health concern. Steviol glycoside D (Reb D), a natural sweetener derived from plants, has gained considerable attention as a sugar substitute due to its zero-calorie content, intense sweetness, and pleasant taste profile.
However, its limited presence in Stevia rebaudiana Bertoni and challenges related to low solubility and enzymatic activity of plant-derived glycosyltransferases have hindered its widespread commercial application. In response to these issues, a novel glycosyltransferase called YojK, originating from Bacillus subtilis 168, was discovered. This study introduces a genetically modified bacterial glycosyltransferase, YojK-I241T/G327N, characterized by high solubility and catalytic efficiency, offering great potential for industrial-scale production of Reb D.
Razvoj visoko učinkovite metode za proizvodnjo rebaudiozida D z uporabo kaskadne reakcije encimov YojK-I241T/G327N in AtSuSy.
Za reševanje problema nizke topnosti rastlinskih glikoziltransferaz so raziskovalci preučili možnost uporabe YojK, O-glikoziltransferaze iz Bacillus subtilis 168. YojK je bila izbrana zaradi dokazane glikozilacijske aktivnosti z različnimi substrati, vključno z velikimi molekulami. Po uspešni rekombinantni ekspresiji in čiščenju je bila YojK uporabljena za glikozilacijo Reb A, kar je privedlo do proizvodnje steviol glikozida D. Analiza encimske kinetike je pokazala, da ima YojK nižjo katalitsko aktivnost za Reb D v primerjavi z drugimi glikoziltransferazami. Posledično študija predlaga potrebo po strukturno usmerjenem inženiringu za izboljšanje katalitske aktivnosti YojK za potencialne praktične uporabe. (kot je prikazano na sliki 1)
Slika 1
Optimizacija reakcijskih pogojev za doseganje visokega izkoristka rebaudiozida D.
Reakcijske pogoje, vključno s pH, temperaturo in koncentracijo substrata, je mogoče optimizirati za doseganje visokega izkoristka steviol glikozida D. Študija je uporabila simulacije molekularne dinamike za preučevanje, kako različica YojK-I241T/G327N izboljša glikozilacijo Reb D. Različica je med simulacijami ohranila stabilno vodikovo vez med Reb A in H14, za razliko od divjega tipa (kot je prikazano na sliki 2). Ta stabilnost se je razširila tudi na razdaljo med atomom O2 Reb A in C1P UDPG. Izboljšana katalitska učinkovitost različice YojK-I241T/G327N je bila pripisana tem stabilnim interakcijam, kar kaže na njen praktični potencial.
Slika 2
Slika 3
Sklep
Ta pristop je prinesel 83,47 % Reb D. Posebej je dodajanje 1 mM UDPG omogočilo sintezo 20,59 g/L Reb D z izjemnim izkoristkom 91,29 %, kar presega prejšnje študije. Ta postopek dokazuje potencial za industrijsko proizvodnjo Reb D, zlasti po strukturnem inženiringu YojK.YojK je mogoče učinkovito izraziti v E. coli BL21 (DE3) z visoko topnostjo. S strukturno usmerjenim inženiringom je bil ustvarjen dvojni mutant YojK-I241T/G327N, ki omogoča obsežno proizvodnjo Reb D z izjemnim izkoristkom 91,29 % z recikliranjem UDPG, ki ga katalizira saharoza sintaza AtSuSy. Ta študija predstavlja YojK-I241T/G327N kot obetavno orodje za ekonomsko učinkovito industrijsko proizvodnjo Reb D.
