Reakcija za doseganje visokega izkoristka stevie rebaudioside D (Reb D) iz Reb A

Prehrana z visoko vsebnostjo sladkorja je privedla do naraščajoče razširjenosti različnih kroničnih bolezni, vključno z debelostjo, sladkorno boleznijo, boleznimi srca in ožilja ter hipertenzijo, kar predstavlja pomembno svetovno skrb za javno zdravje. Stevia Rebaudioside D (Reb D), naravno sladilo, pridobljeno iz rastlin, je pridobila veliko pozornosti kot nadomestek sladkorja zaradi svoje ničelne kalorične vsebnosti, intenzivne sladkosti in prijetnega okusnega profila.
Vendar pa so njena omejena prisotnost v stevia rebaudiana Bertoni in izzivi, povezani z nizko topnostjo in encimsko aktivnostjo glikoziltransferaze rastlinskega izvora, ovirali njeno široko komercialno uporabo. Kot odgovor na te težave so odkrili novo glikoziltransferazo, imenovano YojK, ki izvira iz Bacillus subtilis 168. Ta študija uvaja gensko spremenjeno bakterijsko glikoziltransferazo, YojK-I241T / G327N, za katero je značilna visoka topnost in katalitska učinkovitost, ki ponuja velik potencial za industrijsko proizvodnjo Reb D.

Razvoj visoko učinkovite metode za proizvodnjo rebaudiozida D z uporabo kaskadne reakcije encimov YojK-I241T/G327N in AtSuSy.

Da bi rešili vprašanje nizke topnosti v glikoziltransferazah rastlinskega izvora, so raziskovalci raziskali potencial uporabe YojK, O-glikoziltransferaze iz Bacillus subtilis 168. YojK je bil izbran zaradi dokazane glikozilacijske aktivnosti z različnimi substrati, vključno z velikimi molekulami. Po uspešni rekombinantni ekspresiji in čiščenju je bil YojK uporabljen za glikozilat Reb A, kar je povzročilo proizvodnjo Stevia Reb D. Enzyme kinetična analiza je pokazala, da ima YojK manjšo katalitično aktivnost proti Reb D v primerjavi z drugimi glikoziltransferazami. Zato študija kaže na potrebo po strukturno vodenem inženiringu za izboljšanje katalitične aktivnosti YojK za potencialno praktično uporabo. (kot je prikazano na sliki 1)

Slika 1

Optimizacija reakcijskih pogojev za doseganje visokega izkoristka rebaudiozida D.

Reakcijske pogoje, vključno s pH, temperaturo in koncentracijo substrata, je mogoče optimizirati, da dosežemo visok donos Srevia Reb D. Študija je uporabila simulacije molekularne dinamike, da bi raziskala, kako varianta YojK-I241T / G327N izboljša glikozilacijo Reb D. Različica je med simulacijami ohranila stabilno vodikovo vez med Reb A in H14, za razliko od divjega tipa (kot je prikazano na sliki 2). Ta stabilnost se je razširila tudi na razdaljo med atomom O2 Reb A in C1P UDPG. Izboljšana katalitična učinkovitost različice YojK-I241T/G327N je bila pripisana tem stabilnim interakcijam, kar kaže na njen praktični potencial.

Slika 2

Raziskovalci so uporabili kaskadno reakcijo, ki je vključevala encime YojK-I241T / G327N in AtSuSy. Ključni koraki optimizacije so vključevali vzdrževanje pH pri 8,0 v pufru kalijevega fosfata, reakcijsko temperaturo 35 ° C, 10% sotopilo DMSO in koncentracijo saharoze 400 mM. (kot je prikazano na sliki 3)

Slika 3

Sklep

Ta pristop je prinesel 83,47% Reb D. Dodajanje 1 mM UDPG je omogočilo sintezo 20,59 g / L Reb D z izjemnim donosom 91,29%, kar je preseglo prejšnje študije. Ta proces dokazuje potencial za industrijsko proizvodnjo Reb D, zlasti po gradbenem inženiringu podjetja YojK.
YojK se lahko učinkovito izrazi v E. coli BL21 (DE3) z visoko topnostjo. S strukturno vodenim inženiringom je nastal dvojni mutant, YojK-I241T/G327N, ki je omogočil obsežno proizvodnjo Reb D z izjemnim donosom 91,29% z recikliranjem UDPG, ki ga katalizira saharozna sintaza AtSuSy. Ta študija predstavlja YojK-I241T / G327N kot obetavno orodje za ekonomsko učinkovito industrijsko proizvodnjo Reb D.